Проведение анализа на биологических микрочипах можно разделить на несколько этапов:
пробоподготовку;
взаимодействие молекулярной пробы с элементами биочипа;
регистрацию результатов анализа.
Пробоподготовка в случае олигонуклеотидных биочипов предполагает выделение ДНК или РНК из биологического материала с использованием стандартных протоколов и наработку с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) одноцепочечного фрагмента ДНК, содержащего флуоресцентную, в количествах, достаточных для проведения анализа. Полученную таким образом пробу заливают на биологический микрочип, где идет взаимодействие молекулярной пробы с элементами биочипа.
В основе принципа работы всех молекулярных биочипов с иммобилизованными зондами лежит способность биологических макромолекул к молекулярному узнаванию (высокоспецифичному избирательному связыванию с другими молекулами). Так образование дуплексов ДНК подчиняется правилу Уотсона-Крика, A<->T и G<->C, а рецепторы антител способны различать определенные структуры на поверхности белка. Если соответствие между иммобилизованными молекулярными зондами и мечеными анализируемыми молекулами в растворе точно удовлетворяет условиям молекулярной комплементарности, то образующиеся комплексы будут термодинамически наиболее устойчивы. В результате при определенных температурах их будет больше, чем комплексов, образованных с нарушением условий комплементарности, и, соответственно, совершенным комплексам будет отвечать более сильный регистрируемый сигнал.
Выявление микобактерий туберкулезного комплекса (МТБ) и определение их лекарственной чувствительности к рифампицину и изониазиду при использовании набора ТБ-Биочип и определения лекарственной чувствительности к фторхинолонам при использовании набора ТБ-Биочип-2 достигается проведением ряда последовательных этапов, включающих:
- деконтаминация клинического образца и получение осадка клеток
- лизис и выделение ДНК
- две последовательные стадии мультиплексной ПЦР
- гибридизацию полученных ПЦР-продуктов (ампликонов) на биологическом микрочипе
- регистрацию и интерпретацию полученных результатов.
С целью определения целесообразности проведения гибридизации после первой ПЦР проводится электрофоретический контроль амплификации. Если специфические продукты амплификации присутствует, то образец подлежит последующей (второй) стадии ПЦР и гибридизации. Если продукта нет – указанные стадии не проводятся с выдачей заключения, что количество микобактерий в образце не превышает 500 КОЕ. Таким образом отсеиваются образцы с количеством микобактерий недостаточным для проведения биочип-анализа.
